大鼠转录激活因子4(ATF4)ELISA试剂盒

大鼠转录激活因子4(ATF4)ELISA试剂盒
简介
激活转录因子4（税收反应增强因子B67），也被称为ATF4，由ATF4基因编码的蛋白质，与ATF4相关的疾病包括柯芬-洛里综合征和白质消失的白脑病，它的相关途径包括背角神经元的神经性疼痛信号和磷脂酶-C通路，与该基因相关的基因本体论（GO）注释包括DNA结合的转录因子活性和蛋白异构化活性，该基因的一个重要类似物是ATF5。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术 : 将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物ATF4，清洗后，再加入标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体"免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本ATF4的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从100ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至5000pg/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的5000pg/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将5000pg/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为:  5000pg/mL、 2500pg/mL、 1250pg/mL、 625pg/mL、 312.5pg/mL、 156.25pg/mL、 78.13pg/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0pg/mL)。

抗体工作液配置
使用十分钟前，将100×检测化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×检测化抗体稀释成1×检测化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用十分钟前，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。

备 注：如待测样本ATF4浓度高于标准品高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。

大鼠转录激活因子4(ATF4)ELISA试剂盒
结果的计算    

计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。示例数据以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果。

重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。

灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为39.07pg/mL。
特异性

该试剂盒测定可识别重组大鼠ATF4。

其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。

大鼠转录激活因子4(ATF4)试剂盒仅供科研使用，用于定量检测细胞培养上清、血清、血浆中的大鼠ATF4的含量。